Microscopía multifotón

La microscopía de excitación de dos fotones o multifotonica (MP) es una técnica de obtención de imágenes de fluorescencia que, de forma similar a la microcopia confocal, elimina la luz fuera de foco resultando en imágenes muy nítidas. Ello se consigue mediante la utilización de un láser pulsado, a diferencia de los laseres de emisión continua utilizados en m. confocal convencional, emitiendo en longitudes de onda del infrarrojo (>700 nm). Para la detección de fluorescencia, se pueden utilizar los del m. confocal en el que va instalado aunque, en algunos casos, es necesaria la utilización de detectores acoplados directamente al estativo (detectores directos), que recogen la mayor parte de la luz mejorando la sensibilidad. El principio físico de esta técnica consiste en que las moléculas fluorescentes absorben luz de mayor longitud de onda cuando sobre ellas inciden de forma simultanea 2 o más fotones, un suceso que sólo tiene lugar en el plano focal de la imagen. Por tanto, la luz de fondo (fuera de foco) está fuertemente suprimida y hace innecesaria la utilización de una apertura en el plano conjugado de la imagen utilizada en la m. confocal convencional. Ello, junto con la baja fototoxicidad y dispersión de la luz infrarroja, hacen que la m. MP represente una alternativa superior a la microscopía confocal convencional para inspeccion profunda de tejidos, vivos y/o fijados.